Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКАТФ), осуществляющий вход калия в МХ, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране МХ в 1991 г. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой был выделен белок с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ
В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии Найден целый ряд синтетических активаторов митоКАТФ, являющихся потенциальными кардиопротекторами Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКАТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.
Помимо важной роли митоКАТФ в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.
К настоящему времени нами разработана рабочая модель структуры и регуляции канала, в соответствии с которой митоКАТФ канал состоит из двух субъединиц – канальной (с молекулярной массой 55 кДа) и регуляторной (с молекулярной массой 63 кДа). Однако вопрос о структуре канала и возможной гомологии с другими белками пока остается открытым. Изучение структуры митоКАТФ позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.
В связи с этим, целью данной работы
было: изучить структурную организацию митоКАТФ канала, кардиопротекторное действие УДФ при ишемии миокарда, исследовать параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию.
Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать параметры функционирования митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.
2) Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.
3) Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы.
4) Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ.
5) Исследовать иммунолокализацию МитоКАТФ канала на срезе гепатоцитов и кардиомиоцитах при помощи электронной микроскопии
- Системы транспорта калия в митохондриях
- АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны
- АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ
- Модуляторы митоКАТФ канала
- Функциональная роль митоКАТФ
- Выделение МХ
- Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии
- Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ
- Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа.
- Иммунизация и анализ препарата антител
- Исследование ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода
- Реконструкция белка в БЛМ
- Иммунноэлектронная микроскопия
- MS-MALDI-TOF/TOF- анализ
- Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа
- Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным Белком А
- Ингибиторный анализ с использованием антител к белку с м.м. 55 кДа
- Выделение комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс
- Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных
- Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии
- Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала
- Ингибиторный анализ активности митоКАТФ канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа
- Иммунизация и определение титра полученных антител
- Электронная микроскопия МитоКАТФ канала